Bioinformatics

Genomics 是指研究生物染色體的結構和功能。對於生物染色體的結構來說，人體大概有 3 億個核苷酸 (A、C、G、T) 組成基因組，而基因組又被分成 23 個染色體（22 個普遍的 + XX 或 XY），而每個染色體又有着 centromere 和 telomere。對於基因組的功能來說，它包含了所有身體會使用到的東西，例如呼吸代謝、大腦等等。

Bioinformatics 是 Genomic Data Science 的另一種名稱，它是結合了 biology，statistics 以及 computer science 的一種技術。Bioinformatics 主要是用來收集任何主題的細胞樣本，並對這些樣本執行 sequencing 以產生大量的資料，這些資料會被稱為 reads，接著將這些 reads 與 reference genome（例如標準歐洲男性基因組）對齊，並開始分析差異，最後儲存到公開的 database（例如 NCBI），以便研究者進一步分析。

Why genomics ?

Central dogma 不是標準原則

• Central dogma 不是準則，有非常多的變異點
  • DNA 生成的 Protein 可以回來和 DNA 結合
  • 一些 modifiers (methylation) 可以改變 DNA
• 所以 information 不只順著影響，也會逆向影響

Sequencing

• Sequencing 是 genomics 的核心
  • 了解 gene 的所有影響
  • 因為 sequencing 的進步，可以測出單個 tumor 的 genome
  • 但目前無法完整分析

可以到 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 下載這些已經定序好的 gene data

What is genomics ?

如果是指 structure:

• 人類身體大約有 3 billion 個 nucleotides (As, Cs, Gs, Ts) 組成 genome
  • 所有 genome 都被分成 23 個 chromosomes (22 + XX or XY)
  • Chromosome 又有 centromere 和 telomere

如果是指 function:

• Genome 能做什麼 ?
  • Encode 所有身體會用到的東西
  • Respiration metabolism
  • Building brain

如果是指 evolution:

• 一代一代傳下來的 genome 是幾乎沒有什麼變的
  • 但可以和其他生物比較

Difference between Biology-Genetics and Genomics

	Biology-Genetics	Genomics
Scope	targeted one or few genes	all genes in a genome
Technology	targeted, low-throughput experiments	global, high-throughput experiments
Hard part	設計良好實驗、不斷重複實驗	大數據、大量計算、不確定性

What Is Genomic Data Science?

• Genomic Data Science = Bioinformatics
  • 包含 biology, statistics, computer science

Bioinformatics 在做什麼 ?

1. 收集任意 subject (e.g. human) 的細胞樣本
2. 對樣本執行 sequencing
3. 產生大量的 data
4. 每個 sequences 都是小片段，又稱為 reads
5. 將這些 reads 和 reference genome (e.g. average european male) 對齊
6. 開始分析差異
7. 儲存這些資料、分析結果到公開的 database (e.g. NCBI)
8. 對這些公開資料可以進一步分析

Genomic Data Science

上圖順時針共有 8 個步驟，對應於一些重要領域

• Experimental design (1, 2, 3)
  • 設計出你想研究的東西，產生 data
• Alignment & Assembly (3, 4)
  • 將 data 與 reference genome 對齊，找出差異，集中結果
• Preprocessing & Normalization (4, 5)
  • 避免巨量 data 產生 bias 所以要正規化
• Statistics & Machine learning (5, 7)
  • 用一些技巧來得出結論
• Software development (8)
  • 利用現成軟體來加速進行
• Population genomics (5, 7, 8, 1)
  • 不一定只有找出 cancer 原因，也能找出同一群人的特徵 (e.g. 容易得到疾病)
• Integrative genomics (6, 7, 8, 1)
  • 把所有結果整合

The human genome project

• 1989 開始由 NIH + DOE (US) 主導
  • 一開始目標，在 2005 前 sequence 3 billion basepairs ($1 per base)
• Early 1990s
  • busy creating maps
  • analyze small or large pieces of DNA
• 1995
  • TIGR (Craig Venter)
  • 在 haemophilus influenzae (嗜血桿菌) 序列出完整基因
  • 1.8 million bases
  • 1742 genes
• 1998
  • new sequencing machine
  • Celera Genomics company
• June 2000
  • completion of the human genome
  • "Draft"

How many genes do we have ?

在 3 billion 的 bases 中，有多少 encoded genes ?

• 1964
  • 6.7 million genes?
• Feb 2001 (Nature 409)
  • 30000 - 40000 genes
• Feb 2001 (Science 291)
  • 26588 genes + 12000 likely genes
• Today
  • 99.9% genome have been sequenced
  • 22000 - 23000 genes

Gene count

Project result

• sequence 3 billion basepairs - succeed!
• $1 per base - $1 per 700 bases!
  • 700 bases are one read
• by 2005 - done in 2001!
• Cost today - $1 per 3 million bases!
  • 4000-fold cheaper

Measurement Technology

Polymerase Chain Reaction (PCR)

• PCR 是製作 DNA copy 的一個重大技術
• 用 DNA polymerase 幫助複製
• 因為每做一回合，就拿到雙倍的 DNA copy，是一個 chain reaction

PCR machine

• 製作材料
  • DNA
  • Primers (告訴 DNA polymerase 哪裡開始複製)
  • DNA polymerase
  • A's, C's, G's, T's
• Recipe
  1. 加熱到 94 度 C
  2. 退火 (冷卻) 到 54 度 C
  3. 回溫到 72 度 C
  4. 回到第一步 (約 30 次 cycle)

首先 2 個 primers 附到 DNA 的兩側開頭 (綠色和藍色)

PCR Step 1

慢慢加熱，使得 DNA double-strand 和 primers 都慢慢分開

PCR Step 2

再來慢慢冷卻，不讓 DNA 回復，但讓 primers 回復

PCR Step 3

讓 DNA polymerase 還有一堆 As, Cs, Gs, Ts 加入，開始複製 DNA (溫度些微加熱)

PCR Step 4

我們得到了一倍的 DNA copy，下一輪也是如此

PCR Step 5

通常持續 30 次迴圈，所以共可產生 2^30 個 DNA copy (約十億個 DNA copy)

Next Generation Sequencing (NGS)

• 現在所用的 data 多為 2007 之後 NGS 技術所產生的 sequencing data

Sequencing history

Recall 一下 DNA 是怎麼複製的:

DNA copying

NGS 將大量 template DNA 放在 slide 上面，下圖只用兩個舉例

對大量 template DNA 進行 PCR，產生 copy

NGS Step 1

利用這個原理，對將被用來複製的 nucleotides 塗上顏色

在他們被複製時按下快門，就可以看到顏色得到對應的原 bases

NGS Step 2

重複在每個 base 被加入時拍照，就可以得到原本的 sequence

NGS Step 3

但在越後面的 cycles 會出現越多的錯誤

例如某一些 template 的速度較其他 template 快，某些較慢。所以無法同時一次讀取上千個 base

NGS Step 4

最終結果如下，有的跟在 ACGT 的是 quality value (正確率)

Quality value 由些 base calling 軟體來評估

NGS Step 5

Application of Sequencing

由於 NGS 可以非常快速定序，且又非常便宜，所以產生了一些相關的應用

• Basic idea
  • 轉換一些東西變成 DNA (例如 RNA)
  • 對 DNA 進行 NGS

Exome sequencing

• 人類大約有 1.5% genes (30 to 60 million bases) 是 exons
  • Exons (Exome) 是 genome 中負責 protein-coding 的 genes

Exome

• 為了從一堆 DNA fragment 中取出 exons 的部分
  • 有一個 magnetic bead 的工具
  • Bead 上有 DNA 中的 exon 部分
• 我們將要測試的 DNA 加熱變成 single-strand
  • Exons 會和 bead 上的對應 DNA 結合 (hybridize)
  • 接著就可以把這些 exons 取出進行定序

Exome

這樣就可以只定序到 exome (約 50 - 60 million bases)

RNA-Seq (RNA sequencing)

為了找出哪些 DNA 真的產生蛋白質，可以從哪些 DNA 變成 RNA 開始找起

DNA 在 transcribe 成 RNA 會得到很長的 poly-A tail

所以我們用很長的 Ts 和 As 結合，然後用一些方法把 RNA 從 Ts 拿起來

RNA-Seq Step 1

要定序 RNA 要先轉回 DNA (需要一些病毒所擁有的 reverse transcriptase 幫助)

RNA-Seq Step 2

有了從 RNA 轉回的 DNA，就可以進行定序

RNA-Seq Step 3

再來就可以解決更難的問題，例如找出被該 RNA 啟動的功能

ChIP-Seq

ChIP-Seq 目標是找出 DNA 哪個位置會和蛋白質 (e.g. transcription factors) 結合 (影響 gene expression)

首先找出感興趣的細胞，利用 cross-link 將蛋白質結合 DNA

ChIP-Seq Step 1

接著將 DNA 拆成一片一片，有的沒有蛋白質結合，有的有結合

ChIP-Seq Step 2

然後將特製的 antibodies 放入這群 DNA 碎片中，他會將有蛋白質結合的 DNA 拉出來

ChIP-Seq Step 3

然後就可以把蛋白質移除，對 DNA 定序 !

ChIP-Seq Step 4

Bisulfate sequencing (methylseek)

目標是找出 genome 何處被 methylated (甲基化)

• Methylation 是很重要的 epigenetic modification
  • 也影響了哪些蛋白質會被產生
  • Methylation marks (methyl groups) 可因細胞分裂來傳遞
  • Methyl groups 只會附在 Cytosine (C) 上面

首先將 DNA 分成兩個相等的樣本

Bisulfate sequencing Step 1

對一邊進行 bisulfite conversion，會將沒有甲基化的 C 轉換成 U

Bisulfate sequencing Step 2

然後對兩邊都進行定序，定序同時需要 aligner 幫助對齊比對 (將 U 和原本 C 的位置對齊)

Bisulfate sequencing Step 3

Reference

https://www.coursera.org/learn/introduction-genomics/home/week/1